중합효소 연쇄 반응

3. 원리

PCR은 DNA 복제에 필요한 효소, 프라이머, dNTP 등을 혼합한 용액에 주형 DNA를 넣고 온도 변화를 반복하는 방식으로 진행된다. PCR 과정은 크게 세 단계로 구성되며, 보통 20~40회 반복하여 DNA의 원하는 부분을 증폭시킨다.

초기 PCR은 대장균 DNA 중합효소 I의 클레나우 단편을 이용했다.^[146] 그러나 클레나우 단편은 열에 약해 반응 온도를 37°C로 제한해야 했고, 주기마다 효소를 새로 넣어야 했다. 또한 생성물 최대 길이도 400bp까지였다.^[147] 1988년 테르무스 아쿠아티쿠스(''Thermus aquaticus'')의 DNA 중합효소인 Taq 중합효소를 사용한 논문이 발표되면서 PCR 효율이 크게 향상되었다.^[148]

• 초기화: 핫 스타트 PCR에 의해 열 활성화가 필요한 DNA 중합효소에만 필요하다.^[11] 반응 챔버를 94–96°C (매우 열 안정성이 높은 중합효소를 사용하는 경우 98°C)로 가열하고 1~10분 동안 유지한다.
• 변성: 첫 번째 단계는 DNA를 변성시키는 것이다. 94–98°C로 20~30초 동안 가열하여 이중 가닥 DNA 주형을 단일 가닥 DNA로 분리한다. 분리된 각각의 DNA는 주형으로서 역할을 하게 된다. 변성 온도는 DNA 내 G+C 양과 길이에 따라 달라진다.
• 결합 (어닐링): 두 번째 단계는 프라이머가 주형 DNA에 결합하는 단계이다. 온도를 너무 높게 하면 프라이머가 주형 DNA에 너무 약하게 결합하고, 너무 낮게 하면 비특이적으로 결합하기 때문에 온도를 50–65°C로 20~40초 동안 낮춘다. 결합 온도는 반응의 정확성을 결정하는 중요한 요소이다.
• 신장: 세 번째 단계는 신장 단계이다. 이 단계에서 열에 강한 DNA 중합효소가 주형 DNA에서 새로운 DNA를 만든다. ''Taq'' 중합효소의 최적 활성 온도는 약 75–80°C이며,^[12][13] 일반적으로 72°C가 사용된다. 최적 조건에서 대부분의 DNA 중합효소는 분당 1000개의 염기를 중합한다.

• 최종 연장: 마지막 PCR 사이클 후 70–74°C에서 5~15분 동안 수행하여 남아 있는 단일 가닥 DNA가 완전히 연장되도록 한다. (선택 사항)
• 최종 유지: 반응 챔버를 4–15°C로 무기한 냉각하여 PCR 생성물을 단기 보관한다.

3. 1. 필요한 구성 요소

• 복제할 DNA
• 프라이머: DNA 복제가 시작되는 지점을 제공한다. 증폭 대상 DNA 영역의 양쪽 끝 염기 서열을 결정하고, 해당 프라이머를 인위적으로 합성한다. 이때 프라이머는 증폭 예정인 이중 가닥 DNA의 양쪽 가닥 각각의 3' 말단에 결합하는 상보적인 서열이며, 일반적으로 20개의 염기로 이루어진다. 대부분의 경우 실험실에서 맞춤 제작하거나, 상업적인 생화학 공급업체로부터 구매할 수 있다.^[8]
• DNA 중합효소(Taq): 중합 과정에서 가열과 냉각이 반복되기 때문에 열에 변성이 일어나지 않아야 한다.^[7]
• DNA 중합효소용 완충 용액: 효소가 활성을 얻는 데 필요한 것들이 들어있다.
• dNTP: DNA 합성될 때 재료로 이용되는 3개의 인산이 결합된 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 합성에 필요한 4가지 염기(dATP, dTTP, dGTP, dCTP)의 뉴클레오타이드를 모두 제공해야 한다.
• 이까 양이온: 일반적으로 마그네슘 (Mg) 또는 망가니즈 (Mn) 이온. Mg²⁺가 가장 흔하지만, Mn²⁺는 DNA 합성이 진행되는 동안 오류율을 높이기 때문에 PCR 매개 DNA 돌연변이 유발에 사용될 수 있다.^[9]
• 일가 양이온: 일반적으로 칼륨 (K) 이온

4. 과정

초기의 중합효소 연쇄 반응(PCR)은 대장균의 DNA 중합효소 I (DNA polymerase I)의 클레나우 절편을 이용해 중합효소의 연쇄 반응을 유도하는 방법이었다.^[146] 그러나 클레나우 절편은 열에 약했기 때문에 반응 온도를 37°C로 제한해야 했고, 연쇄 반응을 위해서는 주기마다 효소를 새로 넣어 주어야 했다. 또한 생성물의 최대 길이도 400bp(베이스 페어)까지인 한계가 있었다.^[147] 1988년에는 테르무스 아쿠아티쿠스(''Thermus aquaticus'')의 DNA 중합효소인 Taq 중합효소를 사용한 논문이 발표되면서 PCR의 효율이 크게 향상되었다.^[148]

PCR은 DNA 가닥의 특정 영역(DNA 표적)을 증폭한다. 대부분의 PCR 방법은 0.1 ~ 10 킬로베이스쌍 (kbp) 길이의 DNA 단편을 증폭하지만, 일부 기술은 최대 40 kbp까지 증폭할 수 있다.^[4]

PCR 과정은 일반적으로 20~40번의 반복적인 온도 변화(열 사이클)로 구성되며, 각 사이클은 보통 다음의 2~3단계로 이루어진다.

• '''초기화:''' 핫 스타트 PCR에 의해 열 활성화가 필요한 DNA 중합효소에만 필요한 단계이다.^[11] 반응 챔버를 94°C~96°C (또는 매우 열 안정성이 높은 중합효소를 사용하는 경우 98°C)로 가열하고 1~10분 동안 유지한다.
• '''변성''': 이중 가닥 DNA를 단일 가닥 DNA로 분리한다.
• '''결합''': 프라이머가 단일 가닥 DNA에 결합한다.
• '''신장''': DNA 중합효소가 새로운 DNA 가닥을 합성한다.

• '''최종 연장:''' 마지막 PCR 사이클 후 70°C~74°C에서 5~15분 동안 수행하여 남아 있는 단일 가닥 DNA가 완전히 연장되도록 한다.
• '''최종 유지:''' 반응 챔버를 4°C~15°C로 냉각하여 PCR 생성물을 단기 보관한다.

4. 1. DNA의 변성 (Denaturation)

4. 2. 프라이머의 결합 (Annealing)

4. 3. DNA의 신장 (Elongation)

5. 응용

PCR 기술은 매우 다양한 분야에 응용되고 있다. 생물학은 물론이고, 과학 수사나 친자 감별 등에 사용되는 DNA 지문 분석에도 PCR 법이 이용된다.^[151] PCR은 분자생물학에서 DNA나 RNA를 다루는 데 필수적인 기술로 여겨진다.

PCR의 주요 응용 분야는 다음과 같다:

• '''오염''': 외부 DNA로 인한 오염은 부적절한 산물 생성을 유발할 수 있다. 실험실 프로토콜과 절차를 통해 잠재적 DNA 오염 물질로부터 PCR 혼합물을 분리하여 해결한다.^[6] 범죄 현장의 DNA를 분석하는 경우, 실험실 직원의 DNA가 증폭되어 수사에 혼선을 줄 수 있으므로 주의해야 한다. PCR 설정 구역은 다른 PCR 산물 분석/정제 구역과 분리하고, 일회용 플라스틱 제품을 사용하며, 작업 표면을 철저히 청소해야 한다.
• '''특이성''': 부적절한 산물 생성을 막기 위해 실험 조건을 조절한다. 프라이머 설계 기술은 PCR 산물 수율을 높이고 비특이적 산물 형성을 막는 데 중요하며, 대체 완충제 성분이나 중합효소 효소를 사용하면 길거나 문제가 있는 DNA 영역 증폭에 도움이 된다. 예를 들어 Q5 중합효소는 Taq 중합효소보다 오류 발생 가능성이 약 280배 적다.^[17][18] 실행 매개변수(온도, 사이클 시간)나 포름아미드와 같은 시약 첨가는 PCR 특이성과 수율을 높일 수 있다.^[19] 전자 PCR을 수행하여 프라이머 설계를 지원할 수 있다.^[20]

• 선택적 증폭을 위한 프라이머 제작을 위해서는 표적 서열에 대한 사전 정보가 필요하다.^[25]
• DNA 중합 효소는 오류를 일으키기 쉬워 생성된 PCR 단편에 돌연변이를 유발할 수 있다.^[43]
• 극소량의 오염된 DNA라도 증폭될 수 있어 오해의 소지가 있거나 모호한 결과를 초래할 수 있다.
• 부식산을 포함하는 환경 시료는 PCR 증폭을 억제하여 부정확한 결과를 초래할 수 있다.

5. 1. 질병 진단

5. 2. 법의학

• 유전자 지문 분석: 범죄 현장에서 소량의 DNA를 분리하여 용의자를 특정하거나 무죄를 입증하는 데 사용된다. 인간 게놈의 반복 영역(VNTR, STR)을 증폭하는 PCR을 사용하여 개인별 고유한 DNA 프로필을 생성한다.^[40] FBI는 CODIS라는 DNA 데이터베이스를 구축하여 DNA 샘플 일치 확률을 통계적으로 분석한다.^[40]
• DNA 친자 확인: 덜 구별적인 DNA 지문 분석은 친자 확인에 사용된다. 신원 미상의 유해, 입양 또는 유괴된 어린이, 신생아의 생물학적 부모 확인 등에 활용된다.^[40]
• 성별 결정: PCR AMGX/AMGY 설계는 법의학적 뼈 샘플에서 실시간 성별을 결정하는 데 사용될 수 있다.^[41]

5. 3. 연구 분야

• PCR을 사용하여 게놈 내 특정 DNA 영역을 선택적으로 증폭하고 분리할 수 있다. 이러한 PCR의 이용은 서던 블롯이나 노던 블롯과 같은 혼성화 탐침(hybridization probe) 생성, 특정 DNA 영역에서 유래한 대량의 DNA 단편을 필요로 하는 DNA 클로닝 등에서 널리 활용되고 있다.^[15][16]
• PCR은 DNA 시퀀싱을 수행하는 데에도 종종 중요하다. 다양한 PCR을 통해, 예를 들어 완전히 알려지지 않은 게놈에서 분석 대상 유전자 서열이나 DNA 영역을 추출하여 증폭할 수 있다.
• PCR은 DNA 클로닝과 같은 고전적인 실험 과정에서 많이 활용되고 있다. 예를 들어, 큰 게놈에서 특정 게놈 영역을 벡터에 삽입할 때 등에 사용된다. 또한, 이미 벡터에 삽입된 DNA 단편을 분석하거나 증폭하기 위해 사용할 수도 있다. PCR 프로토콜을 일부 변경함으로써, 삽입 단편의 돌연변이를 인위적으로 유발할 수도 있다.
• 고대 DNA를 대상으로 한 연구에도 PCR은 자주 활용된다. 이러한 고대 DNA는 대부분 자외선이나 가수분해에 의해 분해되어 극미량의 이중 가닥 DNA만 존재하는 경우가 많기 때문에, PCR로 증폭을 거쳐야 비로소 해석이 가능하다. 실제로 PCR을 이용한 연구 사례로는 네안데르탈인의 뼈, 4만 년 전 매머드의 냉동 조직, 이집트의 미라의 뇌 등이 있으며, 이 외에도 러시아 황제나 영국 왕 리처드 3세의 동정 등이 이루어지고 있다.^[106] 경우에 따라서는, 상당 부분 분해되어 버린 DNA 샘플이라도 PCR 증폭을 통해 어느 정도 원래의 DNA 서열을 복원할 수 있는 가능성이 있다.
• 유전자 발현 패턴 연구에도 PCR이 이용된다. 체 조직이나 개별 세포를 다양한 시계열 단계에서 분석하여, 어떤 유전자가 활성화/비활성화되었는지 조사할 수 있으며, 정량 PCR을 사용하여 실제 발현 수준을 상세하게 정량화할 수도 있다.
• PCR은 유전자 연관 연구에도 이용되고 있다. 예를 들어, 개별 정자에서 여러 유전자좌를 동시에 증폭하여 감수 분열 후 염색체 크로스오버를 조사한 연구가 보고되었다.^[109] 이 연구에서는 수천 개의 정자를 분석하여, 매우 가까운 유전자좌 사이의 드문 크로스오버 이벤트를 직접 관찰했다. 마찬가지로, 비정상적인 결실, 삽입, 전좌 또는 역전을 분석할 수 있다.
• PCR을 사용하여 임의의 유전자 또는 게놈 영역의 부위 특이적 돌연변이를 유발할 수 있다. 이러한 변이체를 조사함으로써, 예를 들어 단백질의 기능을 해명하거나, 또는 단백질의 기능을 변경 또는 개선하는 연구를 진행할 수 있다.
• 암의 많은 형태는 암 발생과 관련된 각종 유전자(암 유전자)의 염기 서열 변화를 동반하는데, PCR 기술을 활용하여 이 돌연변이를 분석함으로써 치료 방침을 환자에 맞춰 개별적으로 맞춤화할 수 있다. 또한 PCR은 백혈병이나 림프종 등의 악성 질환의 조기 진단을 가능하게 한다. 암 연구 분야에서 개발이 진행되어 왔으며, 현재 PCR은 일상적으로 사용되고 있다. 게놈 DNA 샘플을 직접 PCR로 분석함으로써 전좌 특이적 악성 세포를 다른 방법보다 최소 10,000배 높은 민감도로 검출할 수 있다는 보고가 있다.^[112] PCR은 또한 종양 억제 인자의 분리와 증폭도 가능하게 한다. 예를 들어, 정량 PCR을 사용하여 단일 세포를 정량하고, DNA나 mRNA, 단백질의 존재량과 조합을 분석하는 것이 가능하다.^[113]

5. 4. 기타 응용

6. 한계

PCR은 매우 민감한 기술이기에, 극소량의 오염된 DNA라도 증폭될 수 있어 오해의 소지가 있거나 모호한 결과를 초래할 수 있다. 이러한 오염 가능성을 최소화하기 위해 연구자는 시약 준비, PCR, 산물 분석을 위한 별도의 방을 마련해야 한다. 시약은 일회용 알리쿼트로 분배해야 하며, 일회용 플런저와 매우 긴 피펫 팁이 있는 피펫을 정기적으로 사용해야 한다.^[14] 실험실 설비는 단방향 워크플로우를 따르도록 하고, PCR 및 분석실에서 사용되는 물질이나 시약은 철저한 오염 제거 없이 PCR 준비실로 가져가서는 안 된다.^[44]

PCR의 주요한 한계점 중 하나는 선택적 증폭을 가능하게 하는 프라이머를 생성하기 위해 표적 서열에 대한 사전 정보가 필요하다는 것이다.^[25] 이는 PCR 사용자가 DNA 중합 효소가 프라이머-주형 하이브리드에 적절하게 결합하여 DNA 합성이 진행되는 동안 전체 표적 영역을 생성하도록 하기 위해, 두 개의 단일 가닥 주형 각각의 표적 영역 상류에 있는 정확한 서열을 알아야 함을 의미한다.

모든 효소와 마찬가지로 DNA 중합 효소도 오류가 발생하기 쉬우며, 이로 인해 생성된 PCR 단편에 돌연변이가 발생한다.^[43]

부식산을 포함하는 환경 시료는 PCR 증폭을 억제하고 부정확한 결과를 초래할 수 있다.

핵산 증폭에는 반응 저해 물질 생성 등으로 인한 반응 효율 저하 등의 영향으로 한계가 있으며, 핵산이 검출 가능한 양까지 증폭되지 못하면 결과는 음성이 되지만, 이 경우 병원체의 존재를 부정할 수 없다.^[96] 혈액, 분변 등 생체 재료 검사에서는 검사 재료 내 저해 물질의 영향을 받을 수 있으므로 정제 작업이 필요하지만, 이마저도 완벽하지 않다고 알려져 있다.^[96]

7. 종류

일반 PCR 외에도 다양한 변형 PCR 기술이 개발되어 활용되고 있다. 주요 변형 PCR 기술은 다음과 같다.

• '''대립유전자 특이적 PCR (ARMS):''' 단일 염기 변이(SNV)를 기반으로 하는 진단 또는 클로닝 기술이다. 대립 유전자 간의 차이를 포함하여 DNA 서열에 대한 사전 지식이 필요하며, SNV를 포함하는 3' 말단에 SNV가 있는 프라이머를 사용한다.^[45]
• '''조립 PCR (PCA):''' 짧은 중첩 세그먼트가 있는 긴 올리고뉴클레오티드 풀에 PCR을 수행하여 긴 DNA 서열을 인공적으로 합성한다.^[47]
• '''비대칭 PCR:''' 이중 가닥 DNA 주형에서 하나의 DNA 가닥을 우선적으로 증폭하며, 염기 서열 분석 및 하이브리드화 프로빙에 사용된다.^[48]
• '''대류 PCR:''' PCR 혼합물에 열 구배를 가하여 대류 흐름을 유도하는 방식으로, 장치 전력 요구 사항과 작동 시간을 줄일 수 있다.^[50]
• '''다이얼 아웃 PCR:''' 유전자 합성을 위해 정확한 DNA 분자를 검색하는 고도로 병렬화된 방법이다.^[52]
• '''디지털 PCR (dPCR):''' DNA 샘플을 고도로 희석하여 많은 PCR을 병렬로 실행한 후, 음성 결과의 비율을 통해 표적 DNA 농도를 계산한다.^[52]
• '''헬리케이스 의존 증폭:''' DNA 헬리케이스 효소를 사용하여 DNA를 풀고, 일정한 온도에서 증폭을 수행한다.^[53]
• '''핫 스타트 PCR:''' PCR 초기 설정 단계에서 비특이적 증폭을 줄이는 기술로, 반응 성분을 변성 온도(예: 95 °C)로 가열한 다음 중합효소를 첨가한다.^[54]
• '''In silico PCR:''' 프라이머의 주어진 세트를 사용하여 DNA 서열을 증폭하기 위한 이론적 PCR 결과를 계산하는 도구이다.^[56]
• '''시퀀스 간 특이적 PCR (ISSR):''' 단순 서열 반복 사이의 영역을 증폭하여 고유한 DNA 지문을 생성하는 DNA 지문 분석 방법이다.^[57]
• '''역 PCR:''' 게놈 삽입물의 주변 서열을 식별하는 데 사용된다.^[58]
• '''리가제 매개 PCR:''' DNA에 연결된 작은 DNA 링커와 해당 링커에 결합되는 여러 프라이머를 사용한다.^[59]
• '''메틸화 특이적 PCR (MSP):''' 게놈 DNA에서 CpG 섬의 메틸화를 감지하는 데 사용된다.^[60]
• '''미니프라이머 PCR:''' 9~10개 뉴클레오티드의 짧은 프라이머에서 확장 가능한 열 안정성 중합효소를 사용한다.^[61]
• '''다중 연결 의존 프로브 증폭 (MLPA):''' 단일 프라이머 쌍으로 여러 표적을 증폭할 수 있다.^[62]
• '''나노 입자 보조 PCR (nanoPCR):''' 일부 나노 입자는 PCR 효율을 향상시킬 수 있다.^[62]
• '''중첩 연장 PCR (SOEing):''' 상보적인 서열을 포함하는 둘 이상의 DNA 단편을 결합하는 유전자 조작 기술이다.^[64]
• '''PAN-AC:''' 등온 조건을 사용하며, 생세포에서 사용할 수 있다.^[66]
• '''PAN-PCR:''' 전체 게놈 서열 데이터를 기반으로 세균 유형 분석을 설계하기 위한 계산 방법이다.^[68]
• '''역 보완 PCR (RC-PCR):''' 단일 폐쇄 튜브 반응에서 생성된 앰플리콘 양 끝에 기능 도메인 또는 선택 서열을 독립적으로 추가할 수 있다.
• '''RNase H 의존 PCR (rhPCR):''' 열 안정성 RNase HII 효소에 의해 제거될 수 있는 3' 확장 블록이 있는 프라이머를 활용한다.^[69]
• '''단일 특이적 프라이머 PCR (SSP-PCR):''' 서열 정보가 한쪽 끝에서만 사용 가능한 경우에도 이중 가닥 DNA 증폭을 허용한다.^[70]
• '''고체상 PCR:''' Polony 증폭, 브리지 PCR 등을 포함한다.^[71]
• '''자살 PCR:''' 고생물유전학 등 가양성 결과를 피하고 증폭 단편의 특이성을 보장해야 하는 연구에 사용된다.^[73]
• '''열 비대칭 연동 PCR (TAIL-PCR):''' 알려진 서열에 인접한 알 수 없는 서열을 분리하는 데 사용된다.^[74]
• '''터치다운 PCR (단계적 감소 PCR):''' PCR 사이클이 진행됨에 따라 어닐링 온도를 점진적으로 낮춰 비특이적 배경을 줄인다.^[75]
• '''유니버설 패스트 워킹:''' 기존 '단면' 접근법보다 특이적인 '양면' PCR을 사용하여 게놈 워킹 및 유전자 지문 분석을 수행한다.^[76]

7. 1. 실시간 PCR (Real-time PCR, qPCR)

7. 2. 역전사 PCR (RT-PCR)

7. 3. 다중 PCR (Multiplex PCR)

7. 4. 중첩 PCR (Nested PCR)

7. 5. LAMP (Loop-mediated isothermal amplification)

참조

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